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“化繁從簡”——食品中脫氫乙酸檢測的前處理優化

2020-01-16

最近,小編在按照標準方法《GB 5009.121-2016 食品安全國家標準 食品中脫氫乙酸的測定 第二法 液相色譜法》做不同的食品基質中脫氫乙酸的檢測實驗時發現,標準方法中處理果汁、烘焙食品、黃油等樣品的操作流程非常繁瑣、耗時長、誤差不可控的步驟過多,且回收率不理想


因此,小編依據脫氫乙酸的性質對實驗過程進行改動優化,發現使用P-SAX小柱(強陰離子交換柱)具有“化繁從簡”的神奇效果,大大提升做樣速度和回收效果~


以下是方法優化過程碰到的問題和一些思考分享,以供各位朋友參考交流~


淨化方法的選擇


首先,小編歸納了國家標準中的不同基質樣品的提取、淨化方法。


果蔬汁、果蔬漿類樣品:

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醬菜、發酵豆製品類樣品:

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麪包、糕點、焙烤食品餡料、複合調味料類樣品:

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黃油類樣品:

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不難看出,國標的處理方法核心思路爲:鹼性溶液提取,提取液用甲酸調節pH後淨化。部分類型樣品的淨化方法包括液液萃取(LLE)與固相萃取(SPE),如液液萃取法淨化後上機結果不理想,則使用C18小柱進行固相萃取。


我們都知道,耗時更短是SPE法相比LLE法的優勢之一,且國標方法中也提及,如果LLE法效果不理想可使用SPE法,說明SPE法淨化效果更有保證


爲了使檢測方法更加快速高效,小編使用固相萃取法作爲淨化方法。


接下來小編將以國標方法12.1.1 为例进行方法验证与方法优化。


方法驗證


爲驗證國標方法中C18小柱的保留效果,小編先使用脫氫乙酸標準溶液進行方法驗證,確保現有實驗條件下,目標化合物使用該方法能被有效回收,才能用來進行樣品處理。

參考的國標方法如下:


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實際操作中,小編做了兩個處理:

1、淨化處理:將脫氫乙酸標液按12.1.1步驟淨化,收集洗脫液過濾上機。

2、未淨化處理:等濃度標液作對照直接上機檢測。

來看一下經過淨化和未經過淨化的樣液脫氫乙酸的回收結果:


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(注:藍色峯爲脫氫乙酸標準溶液,黑色峯爲洗脫液)


不難看出,收集到的洗脫液吸收峯變形嚴重。

考慮到兩者基質溶劑不同,需要考察溶劑對峯形的影響

因此小編又取一定量的標準品儲備液,分別用水、70%甲醇溶液配製成濃度爲1ppm的上樣溶液,上機測定結果,譜圖如下:

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(其中藍色峯爲純水基質,黑色峯爲70%甲醇基質)


由圖可知,直接使用洗脫液上機會存在溶劑效應,需要將洗脫液中的甲醇除去,因此小編在洗脫步驟之後增加氮吹過程去除甲醇


令小編沮喪的是,除去甲醇後,回收率仍然不理想(15.35%)。小編收集了上樣、淋洗步驟的流出液上機檢測,發現目標物未被檢出。結合上述實驗結果看,導致目標物回收率低的情況可能出現在提取環節固相萃取洗脫環節,目標物可能仍保留在小柱上


然而,整個操作過程實在太繁瑣、太不確定!再去追究哪一步出現問題要花大量時間!


綜合整個操作流程,涉及兩個調pH步驟,引入的誤差無法準確控制;樣品提取液較少的時,繁瑣的操作難免導致目標物損失。一方面,檢測結果準確度不好保障,另一方面,繁瑣的流程限制了做樣速度,增加方法改良的時間成本。這樣的方法即便有效也難實現大批量樣品的快速處理。


那麼換個思路進行方法優化如何?


方法優化


小編想,既然原有操作複雜、回收效果也不理想,那麼能否通過更換更合適的SPE小柱,實現對方法的整體優化,達到準確,高效的實驗效果?


小柱的選型要由目標物性質決定,小編首先看了一下脫氫乙酸的化學性質:


脫氫乙酸是吡喃的衍生物,常溫下呈晶體狀。脫氫乙酸晶體難溶於水,在甲醇中溶解度5%(w/w,25℃),水溶液弱酸性,飽和溶液pH=4。其鹽類脫氫乙酸鈉在水中溶解度較大。


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 脱氢乙酸 

     

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脫氫乙酸鈉          

   

這裏小編髮現,脫氫乙酸是一種有機弱酸,其離子化狀態是弱陰離子。那麼,如果能使脫氫乙酸在提取和固相萃取富集環節保持離子化狀態,是否可以利用離子交換機制選擇小柱呢?


考慮至此,小編選定了月旭P-SAX小柱(強陰離子交換柱)作爲SPE淨化柱。使用P-SAX小柱回收脫氫乙酸時,需要注意兩個環節:


鹼性環境中上樣(脫氫乙酸離子化,被小柱吸附);

酸性環境中洗脫(脫氫乙酸變回中性分子,失去與小柱間的作用力,被洗脫)。

             

優化後


在進行了進一步優化後,最終的實驗步驟、譜圖、回收率如下(以洋蔥基質爲例):


1、提取:

稱取2g樣品於50mL離心管,加入5mL氫氧化鈉溶液(1mol/L),定容至25mL,渦旋混勻2min,超聲提取15min,8000r/min離心5min,上清液待淨化。


2、净化

SPE柱:月旭Welchrom® P-SAX,规格:200 mg/6mL。

活化:5mL甲醇,5mL水,棄去

上樣:10ml待淨化液上樣,棄去

淋洗:5mL水,棄去,抽乾

洗脫:5mL10%甲酸甲醇,收集於15ml離心管中,抽乾

濃縮:40℃氮吹至約200μL,用水定容至2ml,過0.45μm水系濾膜後上HPLC檢測。


3、仪器条件

色譜柱:月旭Ultimate®XB-C18, 4.6×250mm, 5μm

流動相:0.02mol/L乙酸銨(pH=10):甲醇=35:65

柱温:35℃

進樣量:20μL
檢測波長:484nm

流速:1.0mL/min


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改進後的提取步驟避免了國標方法中兩次調節pH的繁瑣,操作快速、回收率更加理想。

小編後來又用黃油、辣條、麪包、青團等樣品做了驗證,回收率和RSD均十分理想。

方法改良成功!(鼓掌~~~~)


總結:

在進行脫氫乙酸的檢測中,按方法開發步驟分別進行了洗脫液、SPE小柱類型、前處理方法優化。因此在某種目標物檢測方法改進時,需要針對目標物性質、SPE機制、實驗整體流程三個方面進行,且每一個步驟都需要摸索出最佳條件,從而得出一個穩定、高效的檢測方法。