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His標籤蛋白純化問題解析

2020-11-13

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1. 通過His標籤純化的蛋白,雜質比較多?

可能原因1:蛋白酶會部分降解目的蛋白

解決方法:加入多種蛋白酶抑制劑改進。

可能原因2:雜質蛋白與鎳柱親和力較強

解決方法:可提高雜質蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度。

可能原因3:雜蛋白和目的蛋白結合

解決方法:可通過超聲前加入去垢劑或者還原劑消除(1%-2%Tritonx-100)。

可能原因4:洗滌不充分

解決方法:增加洗滌的次數,充分洗滌。

2. 融合蛋白不掛金屬螯合親和層析柱?

可能原因1:超聲的功率不對(太大,蛋白炭化,太小,蛋白沒有釋放)

解決方法:改變超聲功率或超聲前嘗試添加溶菌酶增加細胞破碎率。

可能原因2:組氨酸標籤暴露不完全

解決方法:在變性條件下(用4-8 M 脲,或4-6 M 鹽酸胍)進行純化,常規Ni-6FF(IDA) ,在變性條件下鎳離子容易脫落,此時可選擇耐受變性劑的螯合填料(推薦月旭材料的親和填料Ni Tanrose FF(NTA))。

可能原因3:His標籤丟失

解決方法:

1.WB 檢查His是否表達,上游構建,改變His-tag的位置(C- 端或N- 端),必要时增加His个数;

2.孵育的時間不夠,降低流速和增加孵育的時間;

3.改變螯合的金屬離子,尋找到z jia的結合金屬離子;

4.選擇高載量高特異性的螯合填料(月旭材料的親和填料 Ni Tanrose FF(IDA) )。

3. 使用幾次後Ni柱載量下降,掛柱效率低,如何處理?

可能原因:逐漸積累沉澱,變性或非特異結合的蛋白佔據了有效的結合位點,而通過洗脫液無法徹底清洗所致

解決方法:

較溫和的清洗方法:用2倍柱體積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌,然後用5倍體積的緩衝液洗滌,以去除沉澱或變性物質。用2倍柱體積的1% Triton X-100洗滌,然後用5倍柱體積的緩衝液洗滌,以去除疏水結合的物質。若改變不明顯,可選擇強烈清洗方式。

強烈清洗方式:首先用5-10倍柱體積的脫鎳緩衝液(20 mM 磷酸鈉, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4)洗滌,進行脫鎳操作,然後用5-10倍柱體積的平衡緩衝液沖洗,最後用5-10倍柱體積的雙蒸水沖洗;隨後進行清洗操作,去除離子型雜蛋白,可以用5倍柱體積的1.5 M NaCl溶液,然後10倍柱體積的雙蒸水沖洗;去除沉澱或變性蛋白,可以用1M氫氧化鈉溶液,結合1-2小時,然後用10倍柱體積的平衡緩衝液和10倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗;去除疏水蛋白或者脂蛋白,可以用5-10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗,然後10倍柱體積的雙蒸水洗滌;最後進行生鎳操作,用0.1M硫酸鎳上柱,隨後5倍柱體積的雙蒸水和平衡緩衝液迚行洗滌,如需保存,保存在20%乙醇溶液。

4. 融合蛋白結合在螯合填料上洗脫不下來?

可能原因1:洗脫條件太溫和(融合蛋白質仍然結合在柱上,結合力較強)

解決方法:增加咪唑的梯度洗脫或降低pH來找出z jia的洗脫條件。

可能原因2:降低pH的方法洗脫,若pH低於3.5,會導致鎳離子脫落

解決方法:改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫。

可能原因3:蛋白已沉澱在柱上

解決方法:

1. 減少上樣量,或使用咪唑的線性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度,或在變性條件(去摺疊)下洗脫(用4-8 M 脲,或4-6 M 鹽酸胍);

2. 蛋白在柱上變性固化,用0.5M氫氧化鈉洗柱。

可能原因4:非特異性疏水或其他相互作用

解決方法:加非離子去污劑到洗脫緩衝液(如:2% Triton X-100)或增加NaCl的濃度。

可能原因5:在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集

解決方法:選擇合適載量的填料,切勿一味追求高載量。

5. 使用過程中發現堵塞嚴重,且流速越來越慢?

可能原因:樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致

解決方法:樣品處理過程中,高速離心,z hao用0.45um的濾膜過濾(推薦)。如果柱子堵塞嚴重,重生時使用1% Triton X-100/PBS浸泡過夜。流速慢,可在柱子下面接一根軟管。

6. 鎳柱使用中出現棕色是怎麼回事?

可能原因:緩衝液中DTT的影響, DTT會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在鹼性的緩衝液條件下,鎳離子會被DTT還原生成棕色的沉澱,所以要儘量避免DTT的參與

解決方法:若樣品中含有DTT,在上樣之前, 我們推薦採用不含還原性試劑的空白運行來除去任何較弱結合的鎳離子;空白運行方法(使用不含還原劑的平衡液和洗脫液)

1)5倍柱體積的雙蒸水洗柱;

2)5倍柱體積的平衡液洗柱;

3)5倍柱體積的洗脫液洗柱;

4)10倍柱體積的平衡液平衡。

當不使用時,勿將Ni Tanrose 6FF(IDA)保存於含還原性試劑的緩衝液中。

7. 上清渾濁,是用IDA好還是NTA好?

上清渾濁,推薦適當稀釋上清,並再次離心或者過0.45um濾膜處理。Ni Tanrose 6FF(IDA)或Ni Tanrose 6FF(NTA)都可純化。

8. 填料是否可以重複使用?可以使用多少次?

如果維護的好的話,填料在其效期之內可以一直重複使用。如果每次都是純化同樣的蛋白就沒有必要剝離掉鎳離子重新掛鎳,一般經過5-7次純化之後可以進行脫鎳和再生鎳的操作。如果柱子反壓高了,填料需要做徹底的在位清洗CIP,在清洗之前,爲了避免金屬鹽的沉澱,需要剝離掉鎳離子,然後再重新掛鎳,清洗後保存在20%的乙醇中。填料的壽命因使用的環境,純化的樣品的特性,保存方式等都有直接關係。

月旭科技秉持分享傳承生物製藥相關技術,彙集生物製藥相關細分技術,以生物技術分享傳承和助力發展爲初衷,月旭科技是集生物分離純化介質研發、生產、銷售於一體的G新技術企業。

公司專注生物分離填料的研製和生物工藝下游技術工藝開發。有瓊脂糖微球填料,葡聚糖微球填料,瓊脂糖交聯葡聚糖微球填料,瓊脂糖交聯纖維素微球填料,瓊脂糖交聯纖維素交聯葡聚糖微球填料,涵蓋離子交換,親和,排阻和疏水等多款高品質填料。